1膜的性質(zhì)及實(shí)驗(yàn)方法

1.1膜的表面張力與微觀結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)采用的生物膜—肺表面活性劑膜萃取自固爾蘇Curosurf豬肺磷脂注射液（80 mg/mL）。固爾蘇主要成分為二棕櫚酸磷脂酰膽堿（Dipalmitoyl-phosphatidylcholine,DPPC），摩爾分?jǐn)?shù)為25%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47%，其余為多不飽和脂肪酸磷脂PUFA–PL（26 mol%）、縮醛磷脂（3.8 mol%）和極少量的膽固醇（0.08 mol%）和蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)采用氯仿?甲醇法對固爾蘇進(jìn)行萃取，制備好的樣品為1 mg/mL的固爾蘇–氯仿溶液，同時(shí)摻混了熒光劑Texas Red（1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt,TR-DHPE），與固爾蘇中DPPC的混合摩爾比為99.8∶0.2。

采用課題組自主研發(fā)的約束液滴表面測量儀（Constrained Drop Surfactometry,CDS）測量膜在不同密度下的表面張力，如圖1所示，圖中x與z分別代表水平與豎直方向，s代表液滴表面切向方向，ψ為液滴表面與水平方向內(nèi)夾角，R0為液滴半徑，ρ為液滴密度，g為重力加速度。CDS上的圓形基座用于盛放純水液滴（約10μL），以微量進(jìn)樣針將稀釋的固爾蘇–氯仿溶液滴定到液滴表面，形成形狀類似于肺泡的水?氣界面固爾蘇肺表面活性劑膜。基座中央的小孔通過導(dǎo)管與注射器相連，注/抽水速度由Labview編程的推進(jìn)器控制，以此調(diào)節(jié)液滴表面積的變化速率。實(shí)驗(yàn)測量的是膜在壓縮過程中表面張力與膜密度變化的關(guān)系，液滴表面積以0.05的準(zhǔn)靜態(tài)速率縮小。液滴的輪廓由照相機(jī)拍攝。膜表面張力和表面積以ADSA（Axisymmetric Drop Shape Analysis）方法分析得出。膜表面壓強(qiáng)，其中，純水表面張力。

圖1約束液滴表面測量儀

圖2為膜表面壓強(qiáng)隨膜密度的變化曲線，（以DPPC磷脂分子所占平均面積作為衡量膜密度的物理量）。在顯微鏡下觀察了膜在不同密度下的形貌（圖2中4張照片）。膜被壓縮到100?2/molecule之前，處于液態(tài)擴(kuò)張（Liquid Expanded,LE）相，磷脂分子排列較松散，膜表面結(jié)構(gòu)均勻。當(dāng)膜被壓縮到60～100?2/molecule時(shí)，膜上開始出現(xiàn)直徑為幾微米的磷脂凝聚（Tilted Condensed,TC）相（照片中斑點(diǎn)），TC區(qū)域內(nèi)磷脂分子的排列比LE區(qū)域更緊密。熒光劑Texas red DHPE傾向于分布在LE區(qū)域，因此LE區(qū)域顯示為淺色，TC區(qū)域顯示為深色。膜繼續(xù)被壓縮，在LE?TC共存相階段，膜表面壓強(qiáng)恒定在45 mM/m左右，TC區(qū)域數(shù)量和面積占比增大。當(dāng)膜被進(jìn)一步壓縮（<60?2/molecule），此時(shí)膜表面幾乎被TC區(qū)域占據(jù)，TC區(qū)域相互擠壓，導(dǎo)致膜表面壓強(qiáng)直線上升，LE區(qū)域僅存在于TC區(qū)域之間的空隙。

圖2肺表面活性劑膜表面壓強(qiáng)隨膜密度的變化

1.2顆粒在膜上的擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)制備

在培養(yǎng)皿中制備顆粒在水?氣界面肺表面活性劑膜上的擴(kuò)散系統(tǒng)時(shí)，為防止顆粒沉淀，水相液體選用密度為1.15 g/mL的蔗糖?氯化鈉溶液，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%，氯化鈉質(zhì)量濃度為9 g/L。選取內(nèi)徑89 mm的玻璃培養(yǎng)皿作為承載膜的容器。先在培養(yǎng)皿內(nèi)倒入厚約1 mm的蔗糖?氯化鈉溶液，之后用微量進(jìn)樣針將固爾蘇?氯仿溶液滴定到蔗糖?氯化鈉溶液表面。本文實(shí)驗(yàn)在界面上滴定了68、102、146和204?2/molecule共4個(gè)密度的膜，對應(yīng)圖2中的4張照片。經(jīng)過3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，膜的形貌未發(fā)生明顯改變。

實(shí)驗(yàn)采用的亞微米顆粒為羧酸鹽修飾的聚苯乙烯熒光微球，直徑分別為0.2、0.5和1.0μm。將該熒光微球稀釋至一定濃度后裝入噴霧器，噴霧器從高處緩緩將顆粒噴灑至膜表面。為防止表面對流干擾顆粒布朗運(yùn)動(dòng)的觀測，使用特氟龍圓環(huán)（外徑12 mm，內(nèi)徑6 mm，高2.5 mm）隔絕出一部分區(qū)域的膜，再蓋上蓋玻片，靜置10 h后，可基本消除表面對流。

1.3顆粒布朗擴(kuò)散的測量

實(shí)驗(yàn)采用Olympus顯微鏡（配備60倍物鏡）觀察顆粒在膜上的布朗運(yùn)動(dòng)，同時(shí)利用電子增益高速攝像機(jī)（Andor 897 EMCCD）進(jìn)行拍攝。每個(gè)視頻拍攝時(shí)間為200 s，幀頻為0.05 s，曝光時(shí)間5 ms，圖像尺寸為300像素×300像素，分辨率為0.26μm/m。采集原始圖像中的顆?；叶戎挡环蠘?biāo)準(zhǔn)高斯分布，因此使用圖像處理軟件ImageJ對圖像進(jìn)行背景去噪聲（Background Subtraction）和高斯模糊（Gauss-ian Blur）處理（圖3（a）），使顆?；叶戎颠_(dá)到標(biāo)準(zhǔn)高斯分布（圖3（b））。之后用Video Spot Tracker軟件定位每個(gè)顆粒的灰度峰值（圖3（c）），即顆粒質(zhì)心，定位誤差僅為0.5像素，進(jìn)而對顆粒二維運(yùn)動(dòng)軌跡（平面）進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤。軟件自動(dòng)將顆粒在每一時(shí)刻的像素位置坐標(biāo)存入計(jì)算機(jī)中，使用MATLAB計(jì)算顆粒在不同時(shí)間間隔Δt內(nèi)沿和方向的位移，計(jì)算公式如下：

圖3圖像處理與顆粒軌跡追蹤示意圖