2結(jié)果與分析

2.1 LOPs的界面性質(zhì)分析

2.1.1 LOPs的潤(rùn)濕性分析

在食品工業(yè)中，濕潤(rùn)性好的成分可能更容易溶解或分散，從而改善食品的質(zhì)地、口感或加工性能。LOPs(固相)、水(液相)和空氣(氣相)三相之間形成的接觸角θ可用于表示LOPs對(duì)水分的親和能力。當(dāng)θ小于90°時(shí)，固體顆粒優(yōu)先被水濕潤(rùn)，θ越小，其在水中的濕潤(rùn)性及分散性越強(qiáng);θ大于90°時(shí)，固體顆粒的親油性更強(qiáng);θ在90°左右，固體顆粒具有兩親性，有利于其在界面的吸附與排列。LOPs的固液氣三相接觸角圖片見圖3，LOPs壓片后與超純水和空氣3次接觸形成的接觸角均為銳角，經(jīng)OSA100型全自動(dòng)界面黏彈性測(cè)量?jī)x測(cè)得接觸角的平均值為(30.40±3.17)°。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，最終水滴完全潤(rùn)濕了LOPs壓片，實(shí)驗(yàn)表明LOPs具有較好的親水性。

圖3 LOPs的固液氣三相接觸角

2.1.2 LOPs的界面張力分析

蛋白質(zhì)在油水界面的吸附過程分3個(gè)階段:擴(kuò)散、吸附、界面處展開與重排，進(jìn)而形成蛋白質(zhì)吸附層。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)具有兩親性，疏水側(cè)朝向油相，親水性側(cè)朝向水相，其能夠吸附在油水界面，降低體系自由能和界面張力。同蛋白質(zhì)一樣，經(jīng)酶解獲得的LOPs同樣具有兩親性，其中疏水性氨基酸占氨基酸總量的33.49%，親水性氨基酸占氨基酸總量的57.69%，LOPs的分子質(zhì)量分布在400～2 300 Da，屬于小分子肽。一般認(rèn)為小肽在油水界面具有較快的擴(kuò)散速率，從而表現(xiàn)出更好的表面活性;也有研究認(rèn)為，較大分子質(zhì)量的肽會(huì)優(yōu)先吸附到界面上。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的LOPs在油相中的液滴形態(tài)及界面張力變化見圖4。由圖4(a)可以判斷LOPs在純化大豆油中存在擴(kuò)散過程，且隨著LOPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，液滴的透光性漸無。這可能是因?yàn)榈唾|(zhì)量分?jǐn)?shù)的LOPs之間存在親水性氨基酸的互斥作用，從而使得LOPs傾向于擴(kuò)散至油水界面處，而隨著LOPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，LOPs持續(xù)擴(kuò)散至界面處直至體系達(dá)到飽和狀態(tài)而失去透光性。由圖4(b)可知，無論LOPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)多大，其在短時(shí)間內(nèi)作用于油水間的界面張力無明顯下降，說明短時(shí)間內(nèi)LOPs并沒有快速吸附到油水界面，LOPs并沒有降低油水間界面張力的能力。

這可能是由于LOPs表現(xiàn)出強(qiáng)親水性，其中的疏水性氨基酸對(duì)大豆油中的酸根離子作用力較小，不足以牽引LOPs分子吸附于界面層，而隨著LOPs濃度的增加，其水溶液在大豆油中的界面張力值越來越小，說明其與大豆油之間的相互作用能降低，更傾向于形成穩(wěn)定的乳液。這可能是因?yàn)橘|(zhì)量分?jǐn)?shù)越大的LOPs分子間作用力越強(qiáng)，并在界面處形成形狀不規(guī)則的肽簇，其中暴露在外的疏水性氨基酸的比例增大。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LOPs不具有降低純化大豆油-水間界面張力的能力(乳化能力)。因此，LOPs雙重乳液的構(gòu)建過程中需在中間相(大豆油)添加一定量的乳化劑(PGPR)以形成穩(wěn)定的W1/O乳液。PGPR是一種油溶性表面活性劑，可引起相間油層的結(jié)構(gòu)變化，可促進(jìn)油相中微小水滴的自發(fā)形成。

圖(a)中液滴下面數(shù)字為L(zhǎng)OPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖4 LOPs水溶液在大豆油中的液滴形態(tài)及界面張力變化

2.2 LOPs雙重乳液體外模擬消化特性分析

2.2.1粒徑分析

在雙乳液遞送系統(tǒng)中，乳液粒徑與分布情況常被用于研究其穩(wěn)定特性。乳液內(nèi)相液滴大小是影響系統(tǒng)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，內(nèi)相液滴尺寸應(yīng)適當(dāng)，數(shù)量多，分布均勻以獲得穩(wěn)定的體系，若液滴尺寸過小，則可能使得液滴之間的碰撞概率增加而破壞乳液的穩(wěn)定性。PDI是衡量顆粒分散均勻性的關(guān)鍵參數(shù)，平均粒徑和PDI可反應(yīng)體系的穩(wěn)定程度。LOPs雙重乳液經(jīng)模擬消化后的平均粒徑、PDI和粒徑分布見圖5。由圖5可知，模擬消化前雙重乳液的平均粒徑為(725.5±25.4)nm(PDI=0.419±0.027)，顆粒粒徑為1 720 nm的占比最高，達(dá)到11.8%。

經(jīng)模擬口腔消化后，乳液的平均粒徑增大為(791.6±20.9)nm(PDI=0.494±0.058)，顆粒粒徑為1 990 nm的占比最高，達(dá)到15.0%。這可能是模擬唾液中的α-淀粉酶附著在界面膜表面導(dǎo)致乳液的表觀粒徑略微增大，也可能是由于環(huán)境中的OH-附著在界面，與模擬消化液中的鹽離子產(chǎn)生了中和作用，導(dǎo)致乳液的負(fù)電荷量減少，使得液滴間的靜電排斥力減弱而導(dǎo)致液滴聚集。經(jīng)模擬胃液消化后，乳液的平均粒徑顯著增大為(944.6±21.8)nm(PDI=0.418±0.076)，此時(shí)，顆粒粒徑為1 990 nm的占比仍最高，達(dá)到16.2%。以吐溫80為外水相乳化劑制備的LOPs雙重乳液對(duì)胃環(huán)境中強(qiáng)酸性、胃蛋白酶、膽鹽和脂肪消化酶有較好的抵抗性，其中吐溫80的聚氧乙烯鏈形成網(wǎng)絡(luò)，為膽汁鹽和脂肪酶的吸附提供了空間障礙，吐溫80得以延緩脂質(zhì)的消化。

根據(jù)吐溫80在油水界面的性質(zhì)，我們初步判斷LOPs雙重乳液在胃消化中仍能保存良好的界面膜，進(jìn)而認(rèn)為外界環(huán)境的低滲作用促使水分通過油相中高濃度的PGPR乳化劑形成膠束轉(zhuǎn)移至內(nèi)水相，使得液滴膨脹。此外，胃液中強(qiáng)酸性使得液滴表面質(zhì)子化，而電解質(zhì)的靜電屏蔽作用降低了液滴表面電位，導(dǎo)致液滴聚集在一起，這也可能是模擬胃消化后液滴粒徑增大的原因之一。最后，經(jīng)模擬腸道消化后，乳液的平均粒徑顯著降低為(772.8±21.4)nm(PDI=0.594±0.042)，顆粒粒徑為1 990 nm的占比最高，達(dá)到11.0%，低于模擬胃消化階段5.2%，說明乳液可能出現(xiàn)破乳現(xiàn)象。

由圖5(b)可知，乳液的粒徑范圍為4 000.0～6 000.0 nm和200.0～400.0 nm的粒徑分布，均大于其他消化階段在此粒徑區(qū)間的粒徑分布。這是因?yàn)椋S著模擬消化時(shí)間的延長(zhǎng)，第一階段的吐溫80對(duì)腸道消化液具有抵抗性，體系中液滴的聚集，使得粒徑增大至5 600 nm，而后存在第二階段為膽汁鹽和脂肪酶突破吐溫80的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，液滴出現(xiàn)破乳現(xiàn)象，進(jìn)而釋放出W1/O型液滴，并使得乳液的平均粒徑下降。液滴破乳，這可能是由于小分子乳化劑膽鹽對(duì)W1/O型液滴中的PGPR乳化劑產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，吸附在W1/O液滴界面處，使得胰蛋白酶能夠進(jìn)一步分解脂肪最終釋放出的LOPs液滴。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在整個(gè)體外模擬消化過程中，LOPs雙重乳液在口腔和胃腸道消化階段可能出現(xiàn)聚集和膨脹現(xiàn)象而導(dǎo)致表觀粒徑逐漸增大，在腸道消化階段可能出現(xiàn)破乳現(xiàn)象，使得表觀粒徑減小，說明以雙重乳液結(jié)構(gòu)體系輸送的LOPs在胃部消化降解延緩，延續(xù)到小腸消化階段產(chǎn)生破乳降解。

不同小寫字母表示不同模擬消化階段的乳液平均粒徑存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 LOPs的雙重乳液經(jīng)模擬消化后平均粒徑、PDI和粒徑分布

2.2.2 LOPs的包封率分析

包封率是生物活性物質(zhì)封裝遞送研究中的指標(biāo)之一，常通過測(cè)定內(nèi)相標(biāo)記物的流出率作為評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的封裝效率，以外相標(biāo)記物的流出率評(píng)價(jià)系統(tǒng)封裝穩(wěn)定性的能力。本研究采用離心法測(cè)定內(nèi)水相物質(zhì)LOPs流出率，評(píng)價(jià)雙重乳液體系在模擬消化階段的封裝效率。LOPs雙重乳液經(jīng)模擬消化后的包封率見圖6。由圖6可知，與消化前乳液相比，經(jīng)模擬口腔消化后LOPs雙重乳液的包封率并無顯著降低(包封率最初為88.35%)，說明此階段不存在或存在較少內(nèi)水相物質(zhì)流出，淀粉酶對(duì)雙重乳液的影響較小，此時(shí)，乳液界面膜結(jié)構(gòu)良好。經(jīng)過模擬胃消化后，乳液的包封率出現(xiàn)顯著性下降，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的振蕩作用下，存在內(nèi)水相的LOPs透過界面膜溶出，但乳液仍保留有較高的包封率(76.80%)，說明該雙重乳液體系所形成的界面膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能抵抗強(qiáng)酸和胃蛋白酶的作用。最后經(jīng)過模擬腸道消化后，乳液的包封率顯著降低(30.01%)。說明經(jīng)過模擬消化過程后，大液滴高度聚集導(dǎo)致界面結(jié)構(gòu)遭到破壞，釋放出內(nèi)部的W1/O型液滴，繼而油相被腸道中的胰酶解離成游離脂肪酸，釋放出內(nèi)部包埋的LOPs。

不同小寫字母表示不同模擬消化階段的包封率存在顯著差異(P<0.05)。

圖6 LOPs雙重乳液經(jīng)模擬消化后的包封率

2.2.3微觀結(jié)構(gòu)分析

圖7是通過光學(xué)顯微鏡拍攝的模擬消化后各階段乳液的形態(tài)。圖7(a)顯示，消化前乳液粒徑大小適宜且分布密集，其中高亮處的乳液粒徑較大，此時(shí)乳液具有良好的穩(wěn)定性;圖7(b)顯示，經(jīng)口腔模擬消化后的乳液分布較為稀疏，但仍存在W1/O/W2雙重乳液結(jié)構(gòu);觀察圖7(c)，經(jīng)模擬胃消化后的乳液整體粒徑較大且分布相較于圖7(b)密集，同時(shí)觀察到中小液滴高密度堆積成帶，說明在強(qiáng)酸和胃蛋白酶存在下，雙重乳液傾向于聚結(jié)在一起，這一結(jié)果增加了液滴間的聚集率，進(jìn)而導(dǎo)致乳液粒徑增大;圖7(d)結(jié)果顯示，經(jīng)模擬腸道消化后的乳液失去原有的多相結(jié)構(gòu)，高度聚結(jié)后的乳液破裂后釋放出W1/O型液滴，又堆積形成大小、形狀不一的大液滴，部分微粒粒徑增大到5 600 nm，而油相經(jīng)膽鹽的乳化作用進(jìn)一步會(huì)形成更小的油滴。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)模擬口腔、胃消化后的乳液仍具有良好的雙重乳液結(jié)構(gòu)，而乳液由于聚集作用，粒徑逐漸增大，最終在模擬腸道消化階段，雙重乳液結(jié)構(gòu)破壞，釋放出的W1/O型乳液在胰酶的作用下分解并釋放出LOPs。

圖(b)中紅圈表示小液滴堆積在大液滴旁邊;圖(c)中紅圈表示小液滴高密度堆積成帶;光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)為(目鏡×物鏡)10×100。

圖7 LOPs的雙重乳液經(jīng)模擬消化后的顯微照片