2.3 LOPs及其雙重乳液體外模擬吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)特性分析

2.3.1 LOPs及其雙重乳液對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性分析

LOPs及其雙重乳液對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。由圖8(a)可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%、0.50%和3.00%的LOPs未能促進(jìn)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng);當(dāng)LOPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過6.00%時(shí)，細(xì)胞存活率極低，推測(cè)此質(zhì)量分?jǐn)?shù)的LOPs對(duì)細(xì)胞的滲透壓過高或過量的物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡;當(dāng)LOPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%～2.50%時(shí)，細(xì)胞存活率(相對(duì)于無LOPs培養(yǎng)液對(duì)照組)均無顯著性差異，出現(xiàn)這類情況可能是由于，LOPs是含有各種氨基酸的多肽，添加了特定濃度的LOPs可能在一定程度上比常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液促進(jìn)了Caco-2的生長(zhǎng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.00%的LOPs，在BL側(cè)可測(cè)得透過的LOPs含量在檢測(cè)的合適范圍，因此選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.00%的LOPs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖8(b)可知，LOPs的雙重乳液對(duì)Caco-2細(xì)胞的存活率的影響隨著乳液稀釋倍數(shù)的提高而不斷上升，這可能與雙重乳液中的乳化劑和大豆油對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性有關(guān)。稀釋倍數(shù)過低的雙重乳液還可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生高滲透作用，若LOPs雙重乳液的稀釋倍數(shù)過高，所含LOPs濃度過低，無法達(dá)到后續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的條件。因此，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用具有較高Caco-2細(xì)胞存活率的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.00%的LOPs、100倍稀釋處理的LOPs雙重乳液進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

不同小寫字母表示各組數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)。

圖8 LOPs及LOPs雙重乳液對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性

2.3.2單層Caco-2細(xì)胞模型的驗(yàn)證

2.3.2.1 TEER的測(cè)定

單層Caco-2細(xì)胞模型的完整性和致密性可以通過TEER進(jìn)行評(píng)估。一般情況下，認(rèn)為當(dāng)單層細(xì)胞的TEER高于300Ω·cm2時(shí)，單層Caco-2細(xì)胞就可以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。圖9為不同初始密度的單層Caco-2細(xì)胞兩側(cè)的跨膜電阻隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況。由圖9可知，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，單層Caco-2細(xì)胞的初始接種密度對(duì)最終電阻的影響不大。前期細(xì)胞跨膜電阻變化緩慢，培養(yǎng)9 d后，跨膜電阻出現(xiàn)大幅度增長(zhǎng)，在培養(yǎng)17 d后的電阻趨于穩(wěn)定，最后的電阻穩(wěn)定于375Ω·cm2附近，表明單層Caco-2細(xì)胞模型具有中度緊密度。

圖9 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)過程中的TEER

2.3.2.2堿性磷酸酶活性的測(cè)定

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)及培養(yǎng)21 d后的堿性磷酸酶活性見圖10。由圖10(a)、(b)可以發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3 d過程中，單層Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定并均勻分布在Transwell上，貼壁情況良好。堿性磷酸酶AKP是小腸刷狀緣細(xì)胞的標(biāo)志酶，其濃度代表了單層Caco-2細(xì)胞的極化和功能。觀察圖10(c)可知，培養(yǎng)21 d后，不同接種細(xì)胞密度在AP側(cè)的酶活性均高于BL側(cè)的酶活性，屬正常的細(xì)胞極化結(jié)果。初始密度為3×105個(gè)/mL的細(xì)胞AP側(cè)的AKP活性高于其他兩組，其BL側(cè)的AKP活性低于其他兩組，證明該組細(xì)胞分化情況較好。隨著細(xì)胞密度的增大，AP側(cè)與BP側(cè)活力的比值呈下降趨勢(shì)，說明初始細(xì)胞密度過大不利于細(xì)胞的分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種模型細(xì)胞均生長(zhǎng)良好。

光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)為10×40;不同小寫字母表示AP側(cè)的組間數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05)，不同大寫字母表示BL側(cè)的組間數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05)。

圖10 Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及培養(yǎng)21 d后堿性磷酸酶的活性

2.3.2.3熒光素鈉透過率測(cè)定

標(biāo)記物跨膜通量的測(cè)定也可以反映單層細(xì)胞膜的完整性，熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線及其在不同時(shí)間段的透過率見圖11。由圖11(a)的熒光素鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，代入BL側(cè)的吸光度，可計(jì)算出BL側(cè)的熒光素鈉質(zhì)量，根據(jù)式(4)，即可得出不同時(shí)間段的熒光素鈉透過率[圖11(b)]。由圖11(b)可知，孵育2 h后，3個(gè)不同初始密度的細(xì)胞模型均對(duì)熒光素鈉具有一定的透過性。初始細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL的細(xì)胞模型對(duì)熒光素鈉的透過率相對(duì)較高，達(dá)到13.96%;初始AP側(cè)加入熒光素鈉的密度為20μg/mL，最終3種模型的熒光素鈉透過量均小于0.011 6μg/min，說明3種細(xì)胞模型單層膜的致密性能良好。

圖11熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線及其透過率

本實(shí)驗(yàn)比較了3種初始細(xì)胞密度培養(yǎng)的細(xì)胞模型，3種模型的Caco-2細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密，均具有良好的致密性和完整性，且已極性分化，表明已成功構(gòu)建了單層Caco-2細(xì)胞模型，3種密度的細(xì)胞模型均可用于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 LOPs及其雙乳液的轉(zhuǎn)運(yùn)方式分析

藥物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過單層Caco-2細(xì)胞模型的表觀滲透系數(shù)(Papp)與其體內(nèi)吸收具有良好的相關(guān)性?，F(xiàn)行國(guó)際物質(zhì)運(yùn)輸判斷標(biāo)準(zhǔn):Papp值高于1×10-5 cm/s，吸收率在70%～100%，表明吸收良好;Papp值為1.0×10-6～1.0×10-5 cm/s，表現(xiàn)出吸收率為20%～70%，表明吸收適中;Papp值<1.0×10-6 cm/s，表現(xiàn)吸收率為0～20%，表明吸收不良。此外，Papp(BL-AP)與Papp(AP-BL)的比值(流出比)是藥物遞送行為的重要指標(biāo)，如果比值小于0.5，則表明主要運(yùn)輸方式是外流效應(yīng)，比值在0.5～1.8，則說明主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為被動(dòng)擴(kuò)散，比值大于1.8，說明主要運(yùn)輸方式是主動(dòng)運(yùn)輸。根據(jù)本研究結(jié)果，我們將3種初始密度不同的單層Caco-2細(xì)胞模型均用于模擬吸收實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果見圖12。由圖12(a)和圖12(b)可知，3種模型的Rapp值均高于1×10-5 cm/s，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單層Caco-2細(xì)胞對(duì)LOPs及其雙重乳液的吸收良好。由圖12(c)可知，LOPs的流出比約為0.7，LOPs雙重乳液的流出比約為0.3，說明LOPs的轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動(dòng)擴(kuò)散，LOPs雙重乳液的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為外流效應(yīng)。然而，相比于LOPs的流出比，LOPs雙重乳液的流出比較小，說明雙重乳液對(duì)LOPs存在緩釋作用。

圖(a)和圖(b)中，不同大寫、小寫字母分別表示LOPs、LOPs雙重乳液的組間表觀滲透系數(shù)存在顯著差異(P<0.05)，圖(c)中，不同大寫、小寫字母分別表示LOPs、LOPs雙重乳液的組間流出比存在顯著差異(P<0.05)。

圖12 LOPs及其雙重乳液的滲透系數(shù)及流出比

3結(jié)論

本研究基于LOPs的界面性質(zhì)，分析包封LOPs的W1/O/W2雙重乳液的體外模擬消化與吸收特性。研究結(jié)果表明，LOPs具有強(qiáng)親水性，但不具有降低油水間界面張力的能力，不具備乳化特性，需添加相應(yīng)乳化劑以穩(wěn)定構(gòu)建包封LOPs的W1/O/W2雙重乳液。體外模擬消化吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:LOPs雙重乳液經(jīng)模擬口腔、胃消化及小腸消化，整個(gè)消化過程乳液粒徑呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)，LOPs的包封率隨之下降;LOPs雙重乳液在胃部酸環(huán)境下發(fā)生聚集，而后到達(dá)腸道消化階段因雙重結(jié)構(gòu)被小腸消化酶降解破裂釋放出大部分的LOPs，表明雙重乳液結(jié)構(gòu)對(duì)LOPs具有一定的保護(hù)及緩釋作用。采用單層Caco-2細(xì)胞模型模擬體外吸收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:單層Caco-2細(xì)胞對(duì)LOPs及其雙重乳液的吸收特性良好，其中，LOPs以被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，而LOPs雙重乳液的轉(zhuǎn)運(yùn)方式為外流效應(yīng);LOPs雙重乳液的流出比小于LOPs的流出比，說明雙重乳液的包封作用對(duì)LOPs具有一定的延長(zhǎng)吸收及長(zhǎng)效作用。研究結(jié)果旨在為闡明包封水溶性生物活性肽的W1/O/W2型雙重乳液的消化、吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供一定參考。