摘要：針對(duì)羥基磷灰石材料強(qiáng)度低、韌度低的問題，本文提出了一種基于LB膜技術(shù)的膠原覆層生物材料制備方法。將膠原蛋白用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解成分子量200~5 000 Da的膠原蛋白肽，利用LB膜技術(shù)制備膠原蛋白肽單分子層，將其覆層至羥基磷灰石片上。采用原子力顯微鏡（AFM）對(duì)覆層的膠原蛋白肽膜進(jìn)行表征，并對(duì)覆層材料進(jìn)行了理化性能分析，最后通過MC3T3-E1細(xì)胞在覆層材料上的培養(yǎng)情況研究其生物性能。結(jié)果表明：AFM發(fā)現(xiàn)膜的表面平整，單層厚度約為3.1 nm，其覆層材料性質(zhì)穩(wěn)定，有良好的力學(xué)性能，楊氏模量最高可達(dá)6.21±0.18 MPa，MC3T3-E1細(xì)胞在覆層材料上生長(zhǎng)良好。因此，可以利用LB膜技術(shù)制備新型膠原覆層材料，為研發(fā)新型醫(yī)用生物覆層材料提供新思路。

近年來，交通事故、自然災(zāi)害、疾病等多種原因造成的人體組織和器官損傷日益增多，人體組織和器官修復(fù)的需求正日益突出。因此，生物材料作為一種新型醫(yī)療功能材料越來越受到研究者的關(guān)注。在對(duì)人體組織或血液無不良影響的前提下，生物材料可以用于治療、修復(fù)或暫時(shí)替代損傷的人體組織和器官。生物材料有天然來源和人工合成兩大類，其中天然來源的材料又分為天然高分子和天然無機(jī)物2種[1]。

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)具有與人骨骼中的無機(jī)鹽極為相似的晶體結(jié)構(gòu)[2,3]，主要用于人骨修復(fù)[4,5]，如牙槽脊增高、口腔種植、骨替換等方面。該材料本身安全、無毒，耐腐蝕強(qiáng)度高，具有良好生物相容性，在臨床上被廣泛應(yīng)用。羥基磷灰石具有傳導(dǎo)骨生長(zhǎng)的特性[6]，即新骨可以從HA與原骨結(jié)合處沿著表面或貫通孔隙繼續(xù)生長(zhǎng)，這種特性是其與骨組織的成分結(jié)構(gòu)相似性的表現(xiàn)。因此，臨床上的HA材料與人骨中磷灰石晶體越相似，醫(yī)療效果越好。然而，材料本身較低的強(qiáng)度和韌性限制了其應(yīng)用范圍，目前主要應(yīng)用于牙科和整形外科等臨床上的低負(fù)荷承載力材料[7]。對(duì)HA材料進(jìn)行覆層[8-10]增強(qiáng)其強(qiáng)度和韌性是該材料的重要發(fā)展方向。

膠原是一種常用的覆層材料，具有良好的生物相容性和組織結(jié)合力[11-13]，可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，引導(dǎo)組織分化。Langmuir-Blodgett(LB)膜技術(shù)是一種新型覆層技術(shù)[14-16]，在氣液界面上將兩親性分子有序排列，形成單分子薄膜，再將其轉(zhuǎn)移到固體表面，可根據(jù)需要通過多次轉(zhuǎn)移得到多層覆層材料，制備的材料覆層均勻可控。通過LB膜技術(shù)將膠原覆層到羥基磷灰石材料上，可以改善材料的性能，研制新型覆層材料。

本研究擬制備分子量均一的膠原蛋白肽，通過LB膜技術(shù)制備單分子層，并將其覆層在羥基磷灰石表面，對(duì)制備的覆層材料進(jìn)行AFM表征，研究覆層穩(wěn)定性，分析其力學(xué)性能變化，考察生物培養(yǎng)性能，為研發(fā)新型醫(yī)用生物覆層材料提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

膠原蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和堿性蛋白酶購自美國SIGMA公司，羥基磷灰石片由中國科學(xué)院過程工程研究所提供，其他試劑均為市售分析純。

LB膜分析儀，原子力顯微鏡(AFM)，高效液相色譜儀(Agilent 1100)，萬能材料試驗(yàn)機(jī)300DX。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1膠原蛋白肽制備

將1 g膠原蛋白加入到50 ml水中，加熱攪拌使其全部溶解，然后加入堿性蛋白酶50 mg，胰蛋白酶20 mg，保持溫度為37℃，pH值為8.0，攪拌反應(yīng)1 h后，將pH值調(diào)為7.0，煮沸滅酶10 min，離心取上清，冷凍干燥，得到膠原蛋白肽備用。

1.2.2膠原蛋白肽分子量分析

使用凝膠過濾色譜法(HPSEC)分析，色譜柱：TSK3000SW(300 mm×7.5 mm I.D.,10μm)；流動(dòng)相：磷酸緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.0)；流速：0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 mL。

1.2.3 LB膜制備

將膠原蛋白肽溶于氯仿，配置成0.5 mg/mL溶液。在LB膜分析儀中加入超純水作為亞相，滴加500μL膠原蛋白肽溶液，揮發(fā)30 min，壓膜速率為5 mm/min。

1.2.4羥基磷灰石覆層

維持表面壓23 mN/m，將羥基磷灰石片浸入亞相中，采用垂直提拉法，使膠原蛋白肽覆層在羥基磷灰石表面，提拉速度為7.5 mm/min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求控制覆層次數(shù)。

1.2.5原子力顯微鏡

用原子力顯微鏡對(duì)羥基磷灰石片上的覆層膠原蛋白肽進(jìn)行觀察，采用間接接觸模式，掃描范圍由大到小，通過NanoScope Analysis軟件處理圖像。

1.2.6穩(wěn)定性分析

為檢測(cè)覆層材料的穩(wěn)定性，將材料浸泡在50倍體積的生理鹽水中24 h，收集浸泡液備用。繼續(xù)用10倍體積生理鹽水反沖洗材料，沖洗10次后收集沖洗液，更換生理鹽水沖洗20次、30次、50次，收集沖洗液。將浸泡液、各次沖洗液濃縮，檢測(cè)其中蛋白含量。

1.2.7楊氏模量測(cè)定

將膠原覆層羥基磷灰石材料置于萬能材料試驗(yàn)機(jī)上，以2 mm/min的速度測(cè)試材料的壓縮應(yīng)力，根據(jù)力與位移的關(guān)系繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線，計(jì)算材料楊氏模量，每個(gè)樣品測(cè)試5次，取平均值。

1.2.8生物性能測(cè)試

用MC3T3-E1細(xì)胞對(duì)覆層材料的細(xì)胞增殖活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過CCK-8法，分為覆層材料組和空白材料對(duì)照組，細(xì)胞培養(yǎng)周期為5天，每天取樣5個(gè)復(fù)孔，每孔分別加入50μL CCK-8試劑，37℃恒溫培養(yǎng)箱中(5%CO2)孵育4 h，每孔吸取100μL樣品，檢測(cè)其450 nm處的吸光度，每組取平均值，繪制細(xì)胞增殖曲線。