2.2不同干燥方式蛋清蛋白的外觀和色澤分析

如圖2所示，EWP-P為細(xì)膩的鵝黃色顆粒粉末，EWP-D為松散的黃色片狀物。EWP-P的L*、a*和b*值分別為53.90±0.23、?2.06±0.70和6.04±0.21。EWP-D的L*、a*和b*值分別為49.89±0.36、?1.65±0.26和3.84±0.50（表1）。EWP-P的b*值較大是因?yàn)榈扒宓鞍字械钠咸烟窃趪婌F干燥過程中與蛋白發(fā)生了美拉德反應(yīng)。此外，真空冷凍干燥需將樣品進(jìn)行冷凍預(yù)處理，冷凍過程中，蛋清蛋白會(huì)發(fā)生褐變反應(yīng)，故EWP-D最終呈現(xiàn)出的顏色較EWP-P黃（圖2）。EWP-P的顏色較EWP-D白（圖2），可能是因?yàn)楦蔁釃婌F干燥的干燥速度快，蛋清中的蛋白質(zhì)受熱時(shí)間短。因此在本實(shí)驗(yàn)干燥條件下，干熱噴霧干燥所得的蛋清蛋白粉更亮、更白，易被消費(fèi)者接受。

2.3不同干燥方式蛋清蛋白的內(nèi)源性熒光分析

蛋白質(zhì)的固有熒光來自于內(nèi)部的芳香族氨基殘基（酪氨酸Tyr、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe），其熒光最大值（λmax）、強(qiáng)度對(duì)其微環(huán)境的極性極其敏感，因此可用來表征蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，其中Trp、Tyr和Phe的特有熒光激發(fā)波長(zhǎng)分別為295、275和258 nm。如圖3所示，與EWP-C相比，不同干燥方式制備的蛋清粉的固有熒光強(qiáng)度降低但熒光峰的位置未有明顯的遷移。EWP-P的熒光強(qiáng)度低于EWP-D于EWP-C，可能是因?yàn)閲婌F干燥的干燥溫度高，蛋清蛋白變性程度大，芳香族氨基酸殘基暴露于更極性環(huán)境中，進(jìn)而發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象。此外，EWP-P的熒光強(qiáng)度較低還可能是由于蛋清蛋白中含有葡萄糖，在高溫下會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，屏蔽了芳香族氨基殘基。

圖3蛋清液及不同干燥方式EWP的內(nèi)源性熒光

2.4游離巰基和表面疏水性分析

總游離巰基包含蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和表面的游離巰基。巰基的變化會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，如溶解度、乳化性和膠凝性能等。如圖4所示，EWP-C、EWP-P和EWP-D的總游離巰基分別是103.81±2.10、93.40±5.93和113.61±7.63μmol/L，其游離巰基分別是41.96±8.31、56.18±2.88和45.39±1.97。與EWP-C相比，EWP-P表面游離巰基含量顯著升高（P<0.05）、總游離巰基含量顯著降低（P<0.05）。而EWP-D與EWP-C相比總巰基和表面游離巰基含量差異不顯著（P>0.05）。這可能與噴霧干燥過程中卵清蛋白的變性有關(guān)，天然狀態(tài)的卵清蛋白中含有埋藏于球狀分子內(nèi)部的游離巰基，而高溫破壞了卵清蛋白的空間結(jié)構(gòu)使內(nèi)部巰基暴露在蛋白表面。三種蛋清蛋白的表面疏水性與表面游離巰基含量變化趨勢(shì)一致，EWP-C和EWP-D的表面疏水性差異不顯著（P>0.05），但其表面疏水性顯著低于EWP-P組（P<0.05），這可能也與噴霧干燥的高溫環(huán)境有關(guān)，該環(huán)境下蛋清蛋白部分展開，導(dǎo)致內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，從而表面疏水性增高。代曉凝等將自然發(fā)酵后的蛋清液分別進(jìn)行冷凍、熱風(fēng)和噴霧干燥處理，比較三種蛋清粉與溴酚藍(lán)的結(jié)合率從而判斷其表面疏水性大小為：冷凍干燥>噴霧干燥>熱風(fēng)干燥，推測(cè)是噴霧干燥發(fā)生美拉德反應(yīng)引入親屬基團(tuán)所致。這與本文研究不一致，可能是因?yàn)榈扒迩疤幚聿煌匀话l(fā)酵時(shí)微生物可能會(huì)改變蛋清蛋白的結(jié)構(gòu)。

圖4不同干燥方式蛋清粉的總游離巰基（TSH）、表面游離巰基（SH）和表面疏水性（H0）

注：相同指標(biāo)不同字母上標(biāo)表示差異顯著（P<0.05）。

2.5傅里葉變換紅外光譜分析

不同干燥方式蛋清蛋白的紅外光譜如圖5所示。EWP-P和EWP-D在酰胺A帶（3700~3200 cm?1）處有強(qiáng)吸收峰，EWP-P的峰強(qiáng)大于EWP-D，表明干燥方式會(huì)影響蛋清蛋白的水合能力，這可能與蛋白質(zhì)分子中N-H鍵舒展并與氫鍵形成了締合體，或蛋白質(zhì)分子與葡萄糖以共價(jià)鍵結(jié)合有關(guān)。酰胺B帶（2961.64 cm?1）的弱吸收峰主要由C-N鍵產(chǎn)生。酰胺I帶（1600~1700 cm?1）信號(hào)主要由C-O鍵伸縮振動(dòng)引起，與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，涉及β-折疊（1600~1640 cm?1）、無規(guī)則卷曲（1640~1650 cm?1）、α-螺旋（1650~1660 cm?1）和β-轉(zhuǎn)角（1660~1700 cm?1）。采用Peak fit軟件對(duì)不同干燥方式蛋清蛋白的酰胺I帶峰強(qiáng)進(jìn)行高斯曲線擬合分析，根據(jù)峰面積計(jì)算其二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)百分含量，結(jié)果如表2。EWP-P和EWP-D的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主，EWP-P的β-折疊含量增加主要與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白熱變性有關(guān)，同時(shí)分子間的β-折疊結(jié)構(gòu)也易轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。而α-螺旋下降可能是因?yàn)闊嶙冃詫?dǎo)致α-螺旋中的氫鍵斷裂，進(jìn)而發(fā)生了解螺旋現(xiàn)象。EWP-P無規(guī)則卷曲增加，表明其部分有序結(jié)構(gòu)向無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化，蛋白變性明顯，結(jié)構(gòu)的隨機(jī)性增強(qiáng)。

2.6不同干燥方式蛋清蛋白的溶解度分析

溶解性是蛋白重要的功能特性之一，與接觸角、表面張力、乳化性等密切相關(guān)。如圖6A，不同pH下不同干燥方式的蛋清粉溶解度的測(cè)量。EWP-P的溶解度隨著pH的升高先減小后增大，這可能是因?yàn)樵谒嵝院蛪A性環(huán)境中球狀蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生部分展開，形成熔融球狀構(gòu)象，變得更加靈活，更容易與水分子作用。pH為6.0時(shí)蛋清蛋白的溶解度最低，可能是因?yàn)樵損H與蛋清蛋白中大部分蛋白的等電點(diǎn)相近，蛋白帶電荷量較少，因此容易發(fā)生沉淀。與EWP-P相比，EWP-D在pH6.0時(shí)溶解度的下降程度較小，這可能與真空冷凍干燥后蛋清蛋白的微觀結(jié)構(gòu)呈片狀，具有較大的比表面積有關(guān)，也可能是因?yàn)槔鋬龈稍锏鞍踪|(zhì)在脫水過程中蛋白質(zhì)變性低，促進(jìn)了可溶性聚集物生成。EWP-D的溶解度遠(yuǎn)大于EWP-P，這是因?yàn)閲婌F干燥是直接將蛋清液霧化后再干燥，其蛋清粉表面會(huì)形成一個(gè)光滑、抗?jié)裥缘谋∧?，最終導(dǎo)致蛋白的溶解性降低，復(fù)水性差且易結(jié)塊。而真空冷凍干燥經(jīng)過冷凍升華，可保持食品原有的形狀故具有很好的速溶性和復(fù)水性。Shaviklo等也發(fā)現(xiàn)噴霧干燥的含添加劑（花粉）蛋白的蛋白質(zhì)溶解度明顯低于凍干蛋白。

圖6不同干燥方式蛋清粉的功能性質(zhì)

2.7不同干燥方式蛋清蛋白的接觸角分析

接觸角值作為時(shí)間函數(shù)的變化，表征了潤(rùn)濕行為，是評(píng)價(jià)粉體潤(rùn)濕性的常用指標(biāo)。當(dāng)樣品的接觸角大于90°時(shí)，表明其疏水性較強(qiáng)，反之則親水性較強(qiáng)。不同干燥方式制備的蛋清蛋白粉與水相的接觸角如圖6B所示，EWP-P在0 s時(shí)的接觸角為99.62°，表現(xiàn)出疏水性特征；EWP-D的接觸角為65.97°，表明其具有較好的親水性。樣品與水滴接觸60 s后，由于水進(jìn)入到了粉末內(nèi)部，兩種樣品的接觸角不斷減小，EWP-P的接觸角下降到97.07°，EWP-D的接觸角下降到59.59°，EWP-D在60 s內(nèi)接觸角的下降速率更大，表明其具有更好的潤(rùn)濕性，這可能與干燥后粉末的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。冉樂童等利用掃描電鏡觀察了冷凍干燥與噴霧干燥蛋清蛋白粉的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)EWP-P粉末是球狀帶孔的結(jié)構(gòu)，且粒徑較小，而EWP-D則呈現(xiàn)出較大、松散的片狀結(jié)構(gòu)。相較于EWP-P的球狀結(jié)構(gòu)，EWP-D的松散片狀結(jié)構(gòu)可能更有利于水分在其內(nèi)部的自由流動(dòng)，因此具有更好的潤(rùn)濕性。