摘要

開(kāi)發(fā)對(duì)宿主細(xì)胞具有良好生物相容性但對(duì)癌細(xì)胞具有高效力的功能性生物材料和藥物是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。通過(guò)利用天然抗菌肽和a-螺旋蛋白的優(yōu)勢(shì)特性，我們?cè)O(shè)計(jì)了一類(lèi)新的短a-螺旋肽G（IIKK）nI-NH2（n細(xì)胞）。我們表明，含有?n1e4的肽具有不同的效力和對(duì)癌癥?3和4的高選擇性，能夠有效殺死癌細(xì)胞，同時(shí)在其工作濃度下對(duì)宿主細(xì)胞保持良性，通過(guò)類(lèi)似于殺菌效果的機(jī)械過(guò)程。細(xì)胞的高選擇性可能源于它們優(yōu)先與帶有負(fù)電荷和高流動(dòng)性的細(xì)胞外膜結(jié)合。除了快速透膜能力外，這些肽還可以通過(guò)線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，而不會(huì)誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)。重要的是，這些肽還可以在小鼠異種移植模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)，而不會(huì)引起副作用。雖然這項(xiàng)研究揭示了這些肽作為強(qiáng)效藥物和其他醫(yī)療保健應(yīng)用的臨床潛力，但它也指出了基礎(chǔ)材料研究在高選擇性肽功能材料未來(lái)發(fā)展中的重要性。

1.導(dǎo)言

尋找高效低毒副作用的新藥已成為功能性生物材料研究的重要方向。盡管治療方法取得了巨大進(jìn)步，但癌癥仍然是全世界致死的主要原因?；熓悄壳爸委煹闹饕呗灾?，尤其是對(duì)于那些處于晚期或轉(zhuǎn)移階段的患者[1]。然而，對(duì)正常細(xì)胞和組織的嚴(yán)重副作用以及癌細(xì)胞容易獲得多藥耐藥性往往與常規(guī)化療藥物密切相關(guān)。因此，開(kāi)發(fā)對(duì)正常宿主細(xì)胞具有低毒性的新型抗癌藥物和不利于耐藥性的獨(dú)特作用模式代表了開(kāi)發(fā)更有效抗癌材料的新方向。這一領(lǐng)域的進(jìn)展可能會(huì)在醫(yī)療保健和治療策略方面開(kāi)辟新的應(yīng)用領(lǐng)域。

一段時(shí)間以來(lái)，天然抗菌肽（AMPs）及其合成類(lèi)似物一直被視為新抗生素的潛在來(lái)源。AMP對(duì)廣泛的微生物表現(xiàn)出不同的抗菌活性，有趣的是，其中一些還表現(xiàn)出對(duì)癌細(xì)胞的毒性，但對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物相容性程度不同[2e4]。此外，由于這些AMP主要通過(guò)非受體介導(dǎo)的途徑作用于靶細(xì)胞膜，與傳統(tǒng)化療藥物相比，癌細(xì)胞更難產(chǎn)生耐藥性[3,4]。由于這些理想的特性，研究和開(kāi)發(fā)具有癌細(xì)胞毒性的AMPs可能會(huì)在開(kāi)發(fā)更好的抗癌藥物方面取得進(jìn)一步進(jìn)展。短的線性陽(yáng)離子AMP在與其靶相互作用時(shí)折疊成兩親構(gòu)象，代表了抗菌肽的一種特別成功的結(jié)構(gòu)安排[5e7]。為了提高其在治療應(yīng)用中的前景，并研究結(jié)構(gòu)活性關(guān)系，已經(jīng)設(shè)計(jì)和合成了許多類(lèi)似物，以模擬天然AMPs的特征，并有不同的成功報(bào)道。主要障礙在于調(diào)整針對(duì)宿主細(xì)胞的毒性的效力。

為了模擬AMPs和含有簡(jiǎn)單a-螺旋重復(fù)序列的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能特征，我們最近開(kāi)發(fā)了一類(lèi)含有簡(jiǎn)單序列重復(fù)序列的短陽(yáng)離子肽，G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）[8]。IIKK模塊在與兩親膜接觸時(shí)促進(jìn)a-螺旋結(jié)構(gòu)，并且隨著n的增加，其結(jié)構(gòu)傾向性提高。C端的額外I殘基穩(wěn)定了分子，進(jìn)一步促進(jìn)了二級(jí)結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性；COO的C端電荷阻斷在觸發(fā)初始響應(yīng)和隨后的選擇性調(diào)節(jié)以響應(yīng)不同的外膜表面時(shí)非常敏感。因此，它們對(duì)抗天然AMP和療法的性能需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

我們發(fā)現(xiàn)這些短合成肽具有很強(qiáng)的抗癌活性。為了探索其實(shí)際相關(guān)性，我們利用成人皮膚真皮成纖維細(xì)胞（HDFa）進(jìn)行了選擇性評(píng)估，采用了我們之前使用NIH 3T3細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法[8]。雖然我們?cè)谶@里的主要目的是研究與所設(shè)計(jì)的肽的細(xì)胞選擇性和抗癌活性相關(guān)的機(jī)械過(guò)程，但本研究也檢查了它們對(duì)人類(lèi)淋巴細(xì)胞的免疫原性反應(yīng)及其對(duì)裸鼠異種移植瘤的治療效果。

2.材料和方法

2.1.化學(xué)試劑與細(xì)胞培養(yǎng)

Rink amide MBHA樹(shù)脂、受保護(hù)氨基酸以及用于肽合成的其他試劑和溶劑從德國(guó)勞埃德生化有限公司（中國(guó)上海）購(gòu)買(mǎi)。3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴化銨（MTT）、鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（鈣黃綠素AM）、4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和異硫氰酸熒光素（FITC）-甲環(huán)素從西格瑪（密蘇里州圣路易斯）獲得。5,50,6,60-四氯-1,10,3,30-四乙基苯并咪唑碳菁碘（JC-1）、抗Cyt c單抗體（小鼠，IgG2b）和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二級(jí)抗體購(gòu)自Beyotime Biotechnology（江蘇，中國(guó)）。所有實(shí)驗(yàn)中使用的水都是經(jīng)過(guò)密理博密理Q去離子處理的（18.2μcm）。

HeLa（人宮頸癌細(xì)胞）和HL60（人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞）由上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供。成人真皮成纖維細(xì)胞（HDFa）是從體外獲得的。癌細(xì)胞系在含有10%熱滅活FBS（胎牛血清）的IMDM（Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，而原代HDFa細(xì)胞在補(bǔ)充了LSGS（低血清生長(zhǎng)補(bǔ)充劑）和抗生素（阿莫西林和青霉素）的M106培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%。

用標(biāo)準(zhǔn)的菲科爾法從全血細(xì)胞中分離人淋巴細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，用10毫升PBS稀釋從健康志愿者獲得的10毫升血液，然后將稀釋后的血液小心地添加到1.077克/毫升的Ficoll溶液中，F(xiàn)icoll與血液的比例為2:1。在2000 rpm下離心15分鐘后，在不接觸Ficoll溶液的情況下收集含有淋巴細(xì)胞的環(huán)。淋巴細(xì)胞用PBS洗滌至少三次，然后懸浮在PBS中使用。

通過(guò)1000 g離心從血液中分離人類(lèi)紅細(xì)胞（h-RBC），用PBS洗滌三次，然后在PBS中懸浮至8%（v/v）以供使用。

2.2.肽合成

G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）肽是使用商用CEM Liberty肽合成器，使用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相肽合成程序制備的。在Rink酰胺MBHA樹(shù)脂上從C端到N端進(jìn)行合成，從而產(chǎn)生C端酰胺化肽。更多細(xì)節(jié)，包括樹(shù)脂的脫保護(hù)、偶聯(lián)和切割，已在前面描述[9e11]。請(qǐng)注意，N端FITC標(biāo)記的G（IIKK）3I-NH2也是通過(guò)固相化學(xué)合成的，我們之前的工作[8]中報(bào)告了詳細(xì)的步驟。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，通過(guò)冷乙醚沉淀至少八次純化粗肽產(chǎn)品，然后冷凍干燥2天。HPLC和MS分析表明，最終產(chǎn)物純度高（>95%）。

2.3.細(xì)胞毒性試驗(yàn)

MTT法檢測(cè)這些肽的體外細(xì)胞毒性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，癌癥或HDFa細(xì)胞（w1105細(xì)胞/mL，100 mL）在96孔板中預(yù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，用100毫升2倍稀釋肽溶液（0e50 mM）處理細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后向每個(gè)孔中加入20毫升MTT溶液（PBS中，5 mg/mL）并培養(yǎng)4小時(shí)。隨后，直接去除HeLa或HDFa細(xì)胞的上清液，而對(duì)于HL60細(xì)胞，以1000 rpm的轉(zhuǎn)速離心培養(yǎng)物5分鐘，然后去除上清液。向每個(gè)孔中加入150 mL二甲基亞砜（DMSO），將孔的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，并使用微孔板讀取器（M2 e，分子裝置）記錄570 nm處的吸光度。不含肽的孔用于對(duì)照，不含細(xì)胞的孔用于分光光度計(jì)的空白。實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行了三次。

通過(guò)檢測(cè)不同肽存在時(shí)h-RBC的血紅蛋白釋放來(lái)測(cè)定肽的溶血活性。將來(lái)自健康志愿者的h-RBC洗滌三次，并以8%（v/v）懸浮在PBS中。將100毫升2折疊肽溶液添加到96孔無(wú)菌板中的孔中。然后將等分（100 mL）的h-RBC懸浮液添加到孔中，以獲得200 mL的總體積。在37℃下將培養(yǎng)皿培養(yǎng)1 h，然后在1000 g下離心5 min。將等分（100 mL）的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔培養(yǎng)皿中，通過(guò)測(cè)量540nm處的吸光度來(lái)監(jiān)測(cè)血紅蛋白的釋放。以PBS和0.1%Triton X-100中的血紅蛋白釋放值作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

2.4.G（IIKK）3I-NH2的細(xì)胞選擇性

為了在體外評(píng)估G（IIKK）3I-NH2的選擇性相互作用，將FITC-G（IIKK）3I-NH2加入含有原代細(xì)胞（HDFa）和腫瘤細(xì)胞（HL60）的共培養(yǎng)系統(tǒng)（8孔板），最終肽濃度為20 mM。在37C和5%CO2孵育1小時(shí)并采用適當(dāng)?shù)姆蛛x程序（詳細(xì)程序見(jiàn)參考文獻(xiàn)8）后，用徠卡DMI3000熒光顯微鏡觀察兩種細(xì)胞中的肽分布。

2.5.肽對(duì)不同脂質(zhì)單分子膜的滲透

在多孔板Kibron微槽X（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）中跟蹤肽滲透到不同的脂質(zhì)單層。表面壓力（p）通過(guò)使用連接到Delta-Pi微天平（芬蘭赫爾辛基Kibron公司）的Wilhelmy板進(jìn)行監(jiān)測(cè)。氯仿中的脂質(zhì)溶液在空氣緩沖界面（10 mM TriseHCl，154 mM NaCl，pH 7.4）擴(kuò)散。在不同初始表面壓力（pi，范圍為10至40 mN/m）下進(jìn)行溶劑蒸發(fā)和單層平衡后，將肽溶液注入單層下方，亞相中的最終肽濃度為3 mM。然后監(jiān)測(cè)表面壓力隨時(shí)間的變化，并在30分鐘內(nèi)獲得平衡表面壓力（pt）。為了比較G（IIKK）3I-NH2穿透飽和（DPPC）和不飽和（POPC）磷脂單分子膜的能力，初始表面壓力保持在30 mN/m左右。所有測(cè)量均在201C下進(jìn)行。

2.6.G（IIKK）3I-NH2在HeLa細(xì)胞中的定位

將HeLa細(xì)胞（w1105細(xì)胞/mL）預(yù)先接種在6孔板中24小時(shí)，然后將FITC-G（IIKK）3I-NH2以10 mM的最終濃度添加到孔中。在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)或24小時(shí)后，用PBS清洗細(xì)胞至少三次。用激光共聚焦顯微鏡（Nikon AI si）觀察FITC-G（IIKK）3I-NH2在HeLa細(xì)胞中的分布。

2.7.膜完整性

HeLa細(xì)胞（w1105個(gè)細(xì)胞/mL）在37C下預(yù)先接種在無(wú)菌96孔板上24小時(shí)。細(xì)胞用PBS清洗，并在37C下用鈣黃綠素AM（1 mM）染色30分鐘。用PBS清洗三次后，向每個(gè)孔中加入100 mL PBS，并通過(guò)微孔板自動(dòng)讀數(shù)器記錄熒光（在490 nm處激發(fā)，在515 nm處發(fā)射），所得值作為對(duì)照。隨后，在37C下用最終肽濃度為10 mM的G（IIKK）3I-NH2處理這些細(xì)胞不同時(shí)間（10 min 6 h）。在肽處理后，用PBS清洗細(xì)胞三次，并再次記錄細(xì)胞在100 mL PBS存在下的熒光。用PBS和1%Triton X-100處理的細(xì)胞分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

為了檢查細(xì)胞形態(tài)變化，將HeLa細(xì)胞（w1105個(gè)細(xì)胞/mL）在無(wú)菌6孔板底部的蓋玻片上預(yù)接種37C 24小時(shí)。預(yù)接種的細(xì)胞在37C下用濃度為10 mM的G（IIKK）3I-NH2處理24小時(shí)，然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS廣泛洗滌固定的細(xì)胞，并用不同濃度的乙醇脫水。在臨界點(diǎn)干燥和用濺射鍍金機(jī)鍍金后，使用JSM-840掃描電子顯微鏡在15 kV下觀察樣品。

2.8.F-肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞核、線粒體膜電位和細(xì)胞色素c的熒光染色

對(duì)于熒光染色，將HeLa細(xì)胞（w1105個(gè)細(xì)胞/mL）預(yù)先接種在6孔板中24小時(shí)，然后向孔中添加最終濃度為10 mM的G（IIKK）3I-NH2。在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，用PBS清洗細(xì)胞，并用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS清洗固定的細(xì)胞，并在37℃下用FITC phalloidin（5 mg/mL）對(duì)其進(jìn)行F-肌動(dòng)蛋白染色或用DAPI（6 mg/mL）對(duì)其進(jìn)行核染色30分鐘。用PBS清洗后去除未結(jié)合的染料，熒光顯微鏡下觀察染色細(xì)胞。

為了跟蹤線粒體電位的變化，肽處理的HeLa細(xì)胞（本例中不使用4%多聚甲醛固定）在37C下用JC-1（10 mg/mL）染色20分鐘。然后用PBS洗滌染色的細(xì)胞，并用熒光顯微鏡觀察。

用抗細(xì)胞色素c單抗（mAb，小鼠IgG2b）對(duì)細(xì)胞色素c（Cyt-c）進(jìn)行免疫熒光染色，觀察細(xì)胞色素c（Cyt-c）在HeLa細(xì)胞中的分布。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在用4%多聚甲醛固定后，用0.1%Triton X-100使肽處理的HeLa細(xì)胞通透性5分鐘，然后用封閉緩沖液（PBS中10%（v/v）胎牛血清）封閉30分鐘。在用PBS洗滌后，這些細(xì)胞在37℃下與抗Cyt c單克隆抗體（1:50）孵育1小時(shí)，并用PBS洗滌5分鐘以去除未結(jié)合的抗體，然后與FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二級(jí)抗體（1:100）孵育1小時(shí)。在用PBS廣泛洗滌以去除未結(jié)合的二級(jí)抗體后，用激光共聚焦顯微鏡觀察這些細(xì)胞。在上述所有熒光染色實(shí)驗(yàn)中，未經(jīng)肽處理的細(xì)胞被用作對(duì)照。

2.9.DNA片段的凝膠電泳

將HeLa細(xì)胞（w1106個(gè)細(xì)胞/mL）預(yù)先接種在無(wú)菌6孔培養(yǎng)皿中24小時(shí)。在37C下與10 mM G（IIKK）3I-NH2培養(yǎng)不同時(shí)間間隔（48、24、12和6小時(shí)）后，收集HeLa細(xì)胞，并在37℃下用裂解緩沖液（0.8%十二烷基硫酸鈉、100 mM三氯化鈉、20 mM EDTA、0.15 mg/mL核糖核酸酶a、pH8.0）裂解2小時(shí)。裂解后，裂解物在50℃下與20 mL蛋白酶K（20 mg/mL）再孵育24小時(shí)，然后在含有0.5 mg/mL溴化乙錠（EB）的2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

2.10.RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)）

為了確定HeLa細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞免疫效應(yīng)的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，HeLa細(xì)胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育不同的時(shí)間間隔（1、3、6和12 h），淋巴細(xì)胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育1 h。按照制造商的說(shuō)明（英國(guó)因維特羅根）用Trizol提取細(xì)胞總RNA?？俁NA（1mg）通過(guò)隨機(jī)引物（PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶，日本Takara）進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用power SYBR green PCR Master Mix kit（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）和7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，并通過(guò)2 DDCt方法的相對(duì)定量分析數(shù)據(jù)。相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平被標(biāo)準(zhǔn)化為管家基因b-肌動(dòng)蛋白的值。使用以下引物：b-肌動(dòng)蛋白義：50-ATGCAGGGTACATGTGGT-30，反義：50-TCGTGCGTGACATTAAGAG-30；aspase-8義：50-ATGGACTTCAGCA-GAAATCTT-30，反義：50-CATGTCATCCAGTTGC-30；fas-sense:50-attatccaaagtgtta-30，反義：50-tcacaatcatctt-CTG-30；fas-L義：50-ATGCAGCCTTCAATT AC-30，反義：50-CAATCTACAGCAAGGCAC-30；IL2義：50-CaCaAttaacctCactCC TGCCAC-30，反義：50-cGTTGATTCTGATTAGCTGTAGTCATCTG-30；IL8順義：50-CGGAAGAACCATCCATCGTGTGG-30，反義：50-AGAATCAGAGAAG GCTGCCAAG-30。

2.11.對(duì)人宮頸癌異種移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

肽，包括G（IIKK）3I-NH2和G（IIKK）4I-NH2，分別表示為3#和4#，在無(wú)菌PBS中溶解，濃度分別為0.15 mg/mL和0.5 mg/mL。當(dāng)腫瘤達(dá)到平均體積100 mm3時(shí)，將PBS中的100 mL人宮頸癌HeLa細(xì)胞（2106個(gè)細(xì)胞/mL）皮下接種到5至6周齡裸鼠（BALB/c-null）的腋窩中（接種后5天），將小鼠隨機(jī)分為五組（每組5只）。通過(guò)腹腔注射將200e250 mL制備好的肽溶液注射到小鼠體內(nèi)，最終劑量為1.5 mg/kg或5 mg/kg，并將200e250 mL PBS注射作為陰性對(duì)照。請(qǐng)注意，我們將這一天定義為第0天。注射每隔一天進(jìn)行九次。在治療期間，每?jī)商鞙y(cè)量一次小鼠的腫瘤大小和體重。在第18天，處死小鼠，移除腫瘤，拍照并稱重。