二、實驗

2.1 材料

二油酰磷脂酰膽堿 (DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸 (DPPS)、膽固醇 (Chol)、棕櫚酰鞘磷脂 (pSM) 和親脂性熒光探針 La-磷脂酰乙醇胺-N-（麗絲胺羅丹明 B 磺?；ㄤ@ 鹽）（雞蛋轉(zhuǎn)磷脂?；?，雞肉）購自 Avanti 極性脂質(zhì)（阿拉巴斯特，阿拉巴馬州）。

在 Cl3CH/CH3OH 2 : 1 v/v 中制備脂質(zhì)混合物 得到 1 nmol mL 的溶液？ 1 總濃度與所有 所使用的溶劑和化學品具有最高的商業(yè)價值 純度可用。 脂質(zhì)單層和雙層的制備 并在 (22 ? 1) 1C 的 0.145 M NaCl 亞相上表征 使用從 Milli-Q 系統(tǒng) (Millipore) 獲得的水，18 MO cm。

透射電子顯微鏡 (TEM) 網(wǎng)格用于 組裝獨立的平面雙層獲得 來自 SPI Supplies（美國西切斯特）。

2.2 方法

2.2.1 脂膜觀察。

經(jīng)典脂筏混合物 含有飽和脂質(zhì)、不飽和脂質(zhì)和膽固醇 被用來進行實驗。 混合物 DOPC : pSM (1 : 1) + 25% Chol 和 DOPC : DPPS (1:2) + 20% Chol 選擇用于中性和帶電域的實驗， 分別。 呈現(xiàn)相分離的組合物是 選擇的目的是觀察和跟蹤領域 單層和雙層的微米尺寸。 為了那個原因 目的是將 1 mol% 的熒光探針加入到 混合物。 由于熒光探針濃度較密 相較低，液相有序相中的域 (Lo) 在顯微照片中顯得更暗。 富集Lo相 每種混合物中的 pSM 和 Chol 或 DPPS 和 Chol。40-44

脂質(zhì)單層的制備和表征使用 Langmuir 薄膜天平（微孔、Kibron、赫爾辛基、 芬蘭）置于倒置熒光的舞臺上 顯微鏡（Axiovert 200，Carl Zeiss，Oberkochen，德國），物鏡為 20、40 或 100。 圖像已注冊 使用 CCD 攝像機（IxonEM+ 型號 DU-897，Andor 技術）。

獨立的平面脂質(zhì)雙層是通過形成的 使用鍍金 TEM 網(wǎng)格的 Langmuir-Blodgett 轉(zhuǎn)移 3 毫米直徑，帶有 200 個六邊形穿孔，每個穿孔 100 毫米。 金表面用十八烷基硫醇修飾 產(chǎn)生疏水性底物，如前所述。 39,45 在進行沉積之前，對網(wǎng)格進行了預處理 1 mL 4% v/v 十六烷的己烷溶液。 一次己烷 蒸發(fā)，剩余的十六烷提供適當?shù)?雙層形成的高原-吉布斯邊界（圓環(huán)）。40,46,47 In 這樣，含有所需混合物的單層被 壓縮到 28 mN m? 1 ，然后表面壓力為 在薄膜轉(zhuǎn)移過程中保持恒定。 這個表面壓力是 足夠高以實現(xiàn)有效的薄膜轉(zhuǎn)移，以及 低到仍然存在相分離，因為臨界 這些混合物在 22 1C 的點接近 33 mN m? 1 . 這 底物通過脂質(zhì)界面垂直下降，并平行于玻璃底部放置 槽，以便使用倒置的觀察雙層 顯微鏡。 雙層保持在亞相下， 穩(wěn)定了幾個小時。

實驗裝置允許原位可視化 沉積后的單層和雙層如圖所示 圖 1A。 單層的代表性圖像和 還顯示了雙層。 中性單層的顯微照片 圖 1B 顯示了在薄膜轉(zhuǎn)移之前。 之后立馬 其轉(zhuǎn)移，雙層熒光出現(xiàn)均勻 （見圖 1C），但在 10-15 分鐘后，相分離 觀察到（圖 1D 和 E）。 這個滯后時間是一致的 自發(fā)變薄過程所需的時間 由于溶劑從雙層中間遷移到 支持邊界。47,48 一些雙層在 當電網(wǎng)容納時轉(zhuǎn)移或通過水通量 觀察，可以在圖 1C 的右下角觀察到。 此外，中性和帶電雙層顯示在 圖1D和E分別。 分析的區(qū)域?qū)?總是在雙層的中心以避免影響 由于靠近高原-吉布斯邊界（方形 在圖1E）。

圖 1 用于生成和觀察朗繆爾單層和平面獨立雙層的實驗裝置 (A)。 代表性圖像顯示 表面壓力為 28 mN m 的中性朗繆爾單層膜？ 1 (B), 轉(zhuǎn)移后立即包含多個同質(zhì)雙層 (C) 的網(wǎng)格, 和 突出顯示的孔（C 中的插圖）的放大圖，以及顯示相共存的中性 (D) 和帶電雙層 (E)。 橙色虛線方塊 (E) 中顯示的是用于分析的區(qū)域的示例。

應該注意的是，用于此的雙層域 研究總是通過兩個半層耦合，并且僅在 孤立的案例域出現(xiàn)解耦，如提議的那樣 此域大小范圍（參見 ESI，? S1）。49 域間斥力隨著距離的減小而變化 在相似區(qū)域的域之間，這是通過 增加液體占據(jù)的總面積 ESI? (S2) 中詳述的有序相 (%Lo)。

據(jù)我們所知，這是第一次，這種雙層 在 TEM 網(wǎng)格上形成的系統(tǒng)用于查看和研究系統(tǒng) 呈現(xiàn)相分離。 注意優(yōu)點之一 這個實驗設置的一個特點是轉(zhuǎn)移后，雙層是 形成在網(wǎng)格的幾乎所有孔中，允許分析 從單個實驗中獲得的多個雙層，以及 改進數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計。

2.2.2 域跟蹤和擴散測量。

在 為了獲得域的擴散系數(shù)（D），對 小域（1-3 毫米半徑）在視頻中被跟蹤 15–20 秒（150–200 幀，每幀 0.1 秒）如所述 50 軟件程序 Image-J 用于執(zhí)行 允許圖像分割和插件"Mosaic Suite" 通過圖像跟蹤粒子。 51 有關更多詳細信息 以及獲得的圖像分割和軌跡的示例 在對流阻力下，參見 ESI?（S3 和 S4）。

2.2.3 域和均值的徑向分布函數(shù) 力相互作用勢。

徑向分布函數(shù) g(r) 是為膜平面上的域計算的 雙層和單層作為數(shù)量的函數(shù) 域，由有序液體的面積百分比量化 相狀態(tài)，%Lo。 150幀的視頻分為三個 部分，以及域中心之間距離的直方圖 (r) 使用來自 50 個連續(xù)幀的數(shù)據(jù)構建，并且 報告的 g(r) 值是平均這些直方圖的結(jié)果。

根據(jù)上述測定，平均力勢為 計算依據(jù)：

其中 b 是 (kT)？ 1 和 w(r) 表示平均力勢 域之間。 52 w(r) 曲線的第一個谷（其中 對應于 g(r) 曲線的第一個峰）被擬合為 二次函數(shù)和從它的曲率一個有效的彈簧 計算常數(shù)，用于量化 域間交互。

2.2.4 域合并。

以量化比率為目的 域的融合，雙層和單層的視頻是 拍攝 15-30 分鐘，中間間隔 5 秒 幀。 相對于第一張顯微照片計算了一段時間內(nèi)的域數(shù)量，每個照片平均 12 張 分鐘。 這些視頻是針對 40%Lo 的膜拍攝的 所有系統(tǒng)，并在 28 mN m 的固定表面壓力下？ 1 在 朗繆爾單層的情況。 時間零是在此刻設置的 在雙層情況下的域外觀，以及在點 達到了單層所需的表面壓力。

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