3.結果和討論

通過CD光譜（圓二色光譜和支持信息中的圖S3）和表面壓力測量（圖S4）對HSA-TR和野生型HSA進行比較表明，染料標記僅輕微干擾HSA的二級結構和疏水性。通過Langmuir-Schaefer技術和AFM，我們證明了在AWI處形成的蛋白質膜可轉移到云母表面，并且類似于一層蛋白質層厚(～3 nm）用于HSA-TR和HSA（圖S5）。這與先前的中子反射率研究（建議為單層）非常一致。16因此，最小標記、接近天然的HSA為通過熒光顯微鏡研究AWI組裝提供了有用的模型蛋白質樣品。

在圖1中，HSA-TR溶解在PBS中（離子強度=193 mM），并在前面所述的小室裝置中成像（圖1A）。當HSA-TR（[HSATR]）的濃度大于或等于0.050 mg/mL時，通過共聚焦顯微鏡觀察到均勻的熒光層，如圖1B所示。光學分辨率為～0.2μm，4倍變焦圖像（圖1C）顯示界面層沒有特殊結構。然而，當[HSA-TR]小于或等于0.025 mg/mL時，在界面處觀察到高度不均勻結構，如圖1D所示。放大圖像（圖1E）顯示HSA-TR組裝成微米大小的分形結構。XZ平面圖像進一步證實了不同的結構，圖1F中觀察到厚度均勻的熒光層，而圖1G中觀察到不連續(xù)的熒光層。我們的結果表明，在PBS中離子強度為193mm的條件下，表面飽和體積溶液濃度（CB sat）在0.025和0.050 mg/mL之間。在CB sat以下，吸附的蛋白質不能完全覆蓋AWI，因此允許在界面處形成蛋白質結構域。以前使用張力測定法和橢偏法的報告發(fā)現(xiàn)，覆蓋AWI的BSA臨界濃度在10-2和10-1 mg/mL之間，13這與我們的結果非常吻合。

盡管蛋白質吸附領域的研究人員普遍接受CB sat的概念，13,34但很少有研究揭示了濃度低于WCB sat的組裝蛋白質的微觀結構。Powers等人報告了在AWI上觀察到由兩親性肽形成的相結構域。23 Lee等人最近利用微流變學進行的一項研究表明，在相對較低的濃度下，AWI的β-乳球蛋白層中存在機械不均一性。在我們之前的研究中，在用俄勒岡州綠標記的人纖維蛋白原的AWI處也觀察到不連續(xù)的熒光層，如果蛋白質在類似的緩沖條件下以0.01 mg/mL溶解。30早期基于2D晶格的模擬預測，在低濃度下，可通過擴散限制聚集形成分形網(wǎng)絡。36 AWI處的XY平面圖像（圖1E）證實了在低亞相濃度下AWI處存在分形組裝和AWI處的異質蛋白質層。

然后，我們改變溶液的離子強度和氧化還原狀態(tài)，并監(jiān)測AWI形成的蛋白質組裝體。在將溶液移液到腔室后，在成像之前將界面老化1小時。PBS中0.010 mg/mL HSA-TR（離子強度=53 mM）的樣品在界面不同位置顯示出分形組裝（圖2A）和相互連接的“瑞士干酪”結構（圖2B）。XY平面圖像的Z疊層顯示了相同條件下界面蛋白質層的高分辨率3D圖像（圖2C）。3D圖像是尺寸為45.0*45.0μm2的多個XY平面圖像的疊加，這些圖像沿AWI上方和下方的Z軸采集，每個方向10μm（200*0.1μm步長）。這證實了界面處的“瑞士奶酪”結構，并且?guī)缀鯖]有顯示來自亞相的熒光信號。雖然沿Z軸的光學分辨率是～2μm對于共焦圖像，其比估計的蛋白質層厚度（30-40?）大得多，Z-stack圖像清楚地表明蛋白質結構域僅在AWI處形成，并且與在XY平面形成的結構域（數(shù)百微米）相比，Z方向上的組裝受到限制。

圖2。蛋白質組裝的形態(tài)，隨離子強度和還原劑的添加而變化。HSATR（0.01 mg/mL）在（A，B）PBS中的AWI下自組裝，pH值7.2，離子強度=53 mM和（C）在掃描體積為45.0*45.0*20.0μm3的情況下，呈現(xiàn)了與圖像B相同的溶液條件對應的共焦圖像Z疊層。（D）PBS，pH值7.2，離子強度=530 mM。（E）30 mM DTT，pH 7.2，離子強度=53 mM的PBS。比例尺：20μm。

在保持蛋白質濃度不變的情況下，我們將緩沖液的離子強度增加到530mm。老化1小時后，我們觀察到均勻熒光層（圖2D），表明表面過剩增加，平衡時間縮短。在緩沖液中含有30mmDTT（圖2E）的樣品中，觀察到小的分形結構，表明吸附蛋白質之間的相互作用較弱。我們還研究了HSA-TR在高離子強度（530mm）的PBS中溶解時界面層形成的動力學。觀察到從密集分形（圖3A）到瑞士奶酪結構（圖3B）以及最終到均勻熒光層（圖3C）的明顯轉變。在大約30分鐘內，AWI達到平衡，形成均勻的熒光層。Dhar等人最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，BSA層的表面粘度急劇增加，并推斷出組織結構發(fā)生了變化。37我們的研究直接顯示了從分形到均勻組織層的形態(tài)轉變，這可以解釋觀察到的抗剪切性增加。

圖3。顯示異質結構域轉變?yōu)橥|層的熒光圖像。C（HSA-TR）=PBS中的0.01 mg/mL，pH值7.2，離子強度=530 mM。（A）3、（B）8和（C）將蛋白質溶液引入試驗箱后36分鐘。標尺：50μm。

我們的結果表明，溶液條件可以調節(jié)蛋白質自組裝的結構。HSA的等電點約為4.7。24因此，在pH值為7.2時，HSA-TR帶負電。靜電排斥強烈影響HSA-TR在AWI處的聚集，導致低包裝效率，如圖2A，B所示。分形結構和瑞士干酪結構共存表明非平衡狀態(tài)，這是由于蛋白質從亞相的緩慢吸附受到界面上已經(jīng)存在的帶電蛋白質的排斥力的阻礙。在較高的離子強度下，帶電蛋白質分子之間的靜電斥力被更有效地屏蔽，HSA-TR吸附到界面的速度更快，并且能夠更緊密地堆積，從而形成更均勻的層。如圖2D和3C所示，AWI的完全覆蓋率低于CB sat。在較低的離子強度（193 mM）下，在吸附時間1 h后，測定CB sat在0.025和0.050 mg/mL之間的值。在較高的離子強度（530mm）下，由于被吸附的蛋白質和來自塊體的蛋白質之間的排斥作用較小，因此塊體溶液蛋白質對AWI的吸附更快。此外，蛋白質分子在界面上的堆積效率更高，從而實現(xiàn)了更高的蛋白質覆蓋率。

據(jù)報道，吸附在AWI上的蛋白質可以形成分子間二硫鍵，從而穩(wěn)定蛋白質網(wǎng)絡并增強吸附層的彈性。38 HSA有一個反應性半胱氨酸，Cys34，可在AWI處與相鄰蛋白質形成二硫鍵。此外，吸附后構象的變化可能導致分子內二硫鍵的斷裂，為分子間二硫鍵的形成提供更多的反應位點。DTT等還原劑抑制分子間二硫鍵的形成，因此只剩下小聚集體，這些聚集體可能通過疏水相互作用結合在一起。Vogler等人應用界面流變學來研究AWI處的HSA，并發(fā)現(xiàn)吸附層既具有粘性又具有彈性。28二硫鍵的形成支持彈性來自分子間相互作用網(wǎng)絡的假設。有趣的是，利用BSA進行的微流變學研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質膜主要是粘性的，沒有形成強的分子間鍵。37因此，AWI處蛋白質二硫鍵的作用可能在不同的蛋白質系統(tǒng)中有很大差異。

最后，將FDA批準的表面活性劑F-127添加到HSA-TR溶液中，以改變AWI處吸附物種之間的疏水相互作用。疏水相互作用導致蛋白質中疏水單元的組裝或聚集，從而降低溶劑化能。39在蛋白質組裝中，多個蛋白質分子的疏水斑塊傾向于聚集在一起，將水從其表面排除，從而增加系統(tǒng)的熵。40當添加更疏水的表面活性劑時，它與蛋白質-蛋白質疏水相互作用競爭。已知表面活性劑在AWI處與蛋白質相互作用，顯著降低表面張力并改變表面層的流變行為。41如Morris等人先前AFM研究中的“造山”模型所述，表面活性劑以非均勻方式從AWI置換蛋白質。19然而，只有BAM研究18提供了現(xiàn)場測量的直接證據(jù)，動態(tài)轉變的各個方面仍然未得到充分探索。

通過我們的原位熒光顯微鏡方法，我們在HSA-TR/F-127混合物的AWI處發(fā)現(xiàn)了熒光強度較強和較弱的區(qū)域，表明發(fā)生了相分離。蛋白質在AWI處形成粘彈性網(wǎng)絡，導致蛋白質的分子遷移率比蛋白質-表面活性劑混合物的分子遷移率小2個數(shù)量級。41因此，我們預計富含蛋白質區(qū)域的熒光恢復速度應比表面活性區(qū)域慢得多。為了驗證這一假設，我們進行了FRAP實驗，用HSA-TR/F-127溶液（HSA-TR為0.10 mg/mL）和F-127溶液（HSA-TR為0.0050 mg/mL）評估界面層的流動性。用近紫外激光束同時漂白強熒光和弱熒光區(qū)域的兩個圓形區(qū)域20 s。在之前和之后拍攝圖像使用衰減的543nm激光作為激發(fā)源進行漂白。照射90秒后，左上方的漂白區(qū)變小，25分鐘后，強度幾乎完全恢復；然而，右下方的漂白區(qū)域并未隨時間改變形狀或強度（圖4）。因此，我們得出結論，強度恢復率的巨大差異表明界面上“富含蛋白質”和“富含表面活性劑”區(qū)域的分離。熒光強度較強的區(qū)域主要由HSA-TR組成，熒光強度較弱的區(qū)域主要由HSA-TR與F-127混合組成。表面活性劑富集區(qū)的蛋白質被表面活性劑分子分離，更容易擴散，使得HSA-TR的橫向遷移率遠高于蛋白質富集區(qū)。然而，熒光恢復期間漂白區(qū)形狀的變化表明，富含表面活性劑的區(qū)域中的質量傳輸不均勻。結合多種擴散過程的適當分析方法，F(xiàn)RAP實驗有可能確定AWI處蛋白質分子擴散系數(shù)的分布。

圖4。界面層光漂白后的熒光恢復。ROI（黃色圓圈）是選定的光漂白區(qū)域。ROI-1位于富含表面活性劑的區(qū)域，而ROI-2位于富含HSA TR的區(qū)域。初始亞相濃度為[HSA-TR]=0.10 mg/mL和[F-127]=0.0050 mg/mL。比例尺：20μm。

我們發(fā)現(xiàn)在HSA-TR/F-127混合物中，蛋白里奇區(qū)表現(xiàn)出隨時間變化的形態(tài)變化，這促使我們更詳細地研究這一動態(tài)現(xiàn)象。圖5所示的結果是通過將HSA-TR（0.50 mg/mL）與F-127（0.015 mg/mL）混合，聚焦在AWI上拍攝的圖像。圖5A顯示了將溶液用移液管移入腔室后35至60分鐘內聚焦在同一區(qū)域的三幅圖像?？梢娒娣e為10-100μm2的小圓形蛋白質島。感興趣區(qū)域（ROI，由圖5中的黃色方框表示）突出顯示了一些有趣的觀察結果：在ROI-1中，與35分鐘時的圖像相比，小的蛋白質島在50分鐘時與周圍的蛋白質島結合形成一個更大的島。在ROI-2中，從50分鐘開始可以看到小黑洞，表明F-127在這些位點取代了HSA-TR，并在富含蛋白質的區(qū)域內形成空腔。在ROI-3中，可以觀察到表面活性劑富集區(qū)前沿的移動。很明顯，隨著時間的推移，表面活性劑富集區(qū)不斷擴大。在ROI-4中，小的蛋白質島合并成網(wǎng)狀網(wǎng)絡。

圖5。蛋白質島隨時間的聚合。（A）導入后35、50和60分鐘拍攝的共焦熒光圖像。比例尺：20μm.（B）蛋白質島大小分布的直方圖。初始亞期濃度為[HSA-TR]=0.50 mg/mL和[F-127]=0.015 mg/mL。ROI-1表示一個區(qū)域（黃色框），其中小的蛋白質島與周圍的蛋白質島結合形成一個較大的島；ROI-2表明該區(qū)域形成了小黑洞；ROI-3表示在表面活性劑富集區(qū)域的邊界處的運動；ROI-4顯示了小的蛋白質島合并成網(wǎng)狀網(wǎng)絡的地方。

我們使用ImageJ分析了蛋白質島的大小分布（圖5B）。31面積分數(shù)定義為相同大小的蛋白質島的表面積除以蛋白質島總面積的總和。圖5B顯示了島嶼規(guī)模分布的明顯增長趨勢。蛋白質島的平均面積從24μm2（35分鐘）增加到57μm2（60分鐘）。通過使用30幀/秒的更快掃描速率（支持信息中的電影S1，其中電影中的圖像顯示速度比實時慢10倍）也觀察到蛋白質島的運動，并且觀察到蛋白質島表現(xiàn)出類似于單層脂質結構域布朗運動的運動。42重要的是，觀察到鄰近島嶼在接觸時結合在一起。富含蛋白質的結構域的存在表明蛋白質和表面活性劑在動力學過程中共同吸附到界面。蛋白質分子之間的強相互作用促進了結構域的形成和結構域的合并，從而阻止了表面活性劑的置換。然而，F(xiàn)-127的界面占有率在熱力學上是有利的，其中F-127在0.015 mg/mL時的平衡表面張力約為40 mN/m43，而HSA在0.50 mg/mL時的平衡表面張力為52-60 mN/m。34因此，隨著時間的推移，蛋白質結構域逐漸被表面活性劑從本體中置換，以降低表面能。

表面活性劑穿透蛋白質結構域的觀察和表面活性劑富集區(qū)的擴展符合造山模型。該模型表明，表面活性劑首先穿透蛋白質層，形成缺陷或孔洞，從而取代界面上的蛋白質。然后，隨著表面活性劑繼續(xù)在這些區(qū)域累積，表面活性劑區(qū)域擴張，蛋白質層被迫彎曲并延伸到亞相，直到蛋白質層最終坍塌。1,19在肺表面活性物質/聚乙二醇/白蛋白混合物中顯示了不同的置換機制，這表明競爭吸附過程可能依賴于系統(tǒng)。在表面張力和表面流變學研究中，44個理論模型已被開發(fā)用于解釋蛋白質/表面活性劑混合溶液的吸附動力學和平衡狀態(tài)。41作為對這些研究的補充，我們的工作提供了關于蛋白質和表面活性劑在界面上的位置以及組裝結構的更詳細信息。在我們的研究中觀察到的聚結現(xiàn)象表明，相鄰的蛋白質結構域有重組連接網(wǎng)絡的趨勢，而其他蛋白質正被表面活性劑取代，因此突出了HSA-TR/F-127混合物中蛋白質結構域聚結和表面活性劑取代蛋白質的兩個競爭過程。

應用熒光顯微鏡研究了蛋白質在氣-水界面的組裝——摘要、介紹

應用熒光顯微鏡研究了蛋白質在氣-水界面的組裝——材料和方法

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