結(jié)果和討論

表面壓縮性和酶活性。 純DMPA和混合DSAP/DMPA單層的表面壓力分子面積等溫線如圖1所示，與先前的結(jié)果一致。20,40對(duì)于純DMPA單層，每個(gè)分子在55和44?2之間存在一個(gè)典型的平臺(tái)，對(duì)應(yīng)于液體膨脹（LE）和液體冷凝（LC）相的共存區(qū)， 而LE-LC轉(zhuǎn)變發(fā)生在8.0mn/m。 與此相反，DSAP/DMPA混合單分子膜不存在共存區(qū)，液相膨脹相保持，直到表面壓力達(dá)到20 mN/m以下。

圖1.朗繆爾單分子膜的表面壓力-面積曲線：純DMPA（O）和DSAP/DMPA（1:3500，mol:mol）（4）。 曲線中顯示的斷點(diǎn)與混合單層的LE-LC轉(zhuǎn)變有關(guān)。

值得注意的是，為了避免不可逆的酶聚集，蛋白質(zhì)被分散在預(yù)成型的DMPA單分子膜上，而不是注入亞相。 此外，溶解酶儲(chǔ)備溶液中的C12（EO）9 0.01%在擴(kuò)散后進(jìn)一步稀釋，這無(wú)疑有利于酶在界面上的位置，我們可以將此過(guò)程確定為“無(wú)表面活性劑酶的表面滲透”。 這一過(guò)程是實(shí)驗(yàn)條件的結(jié)果，因?yàn)樵趤喯嘀袑⒈砻婊钚詣┫♂屩?0-6%（或0.21μmol/L）會(huì)使系統(tǒng)進(jìn)一步低于堿性磷酸酶/C12（EO）9（3.6μmol/L20,22）混合系統(tǒng)的臨界聚集濃度（CAC）42。 事實(shí)上，表面活性劑的稀釋已被用作誘導(dǎo)GPI錨定蛋白質(zhì)分子層吸附的成功方法。22,27此外，先前的數(shù)據(jù)20,22表明，向體積濃度為0.21μM的純水中添加C12（EO）9不會(huì)引起表面張力的變化， 既不適用于清潔空氣/水界面，也不適用于DMPA單層。

與酶表面沉淀過(guò)程相關(guān)的疏水性錨定物的存在強(qiáng)烈表明，酶的總擴(kuò)散量應(yīng)保持在與磷脂形成混合單層的空氣/液體界面，而底物（PNPP）及其水解產(chǎn)物（對(duì)硝基苯酚和無(wú)機(jī)磷酸鹽） 應(yīng)保持在子階段。 這與一些關(guān)于脂肪酶催化活性的報(bào)告43-48大不相同。 在這些研究中，酶被注射到亞相，在吸附到界面后，它會(huì)對(duì)該界面上的脂質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾。 相比之下，在目前的研究中，脂質(zhì)單層充當(dāng)酶的基質(zhì)，并且在化學(xué)上不受影響。 此外，在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中未觀察到PNPP水解：在側(cè)隔室中未檢測(cè)到吸光度或活性，這意味著酶在亞相中未溶解。 另一方面，在存在混合單層的中央腔室中檢測(cè)到催化活性。 這一結(jié)果明確地表明，在所采用的實(shí)驗(yàn)條件下，酶沒有分散在亞相中，而是完全吸附在氣液界面上。 還估計(jì)了在無(wú)酶的情況下PNPP的自發(fā)水解，考慮到實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間間隔，可以忽略。

在5到18 mN/m的表面壓力下，DMPA的表面密度從1.45×1017分子/m2變化到2.30×1017分子/m2。 考慮到DMPA和DSAP都保留在界面上，單層的壓縮應(yīng)減少磷脂和蛋白質(zhì)的可用面積。 因此，可以估計(jì)酶的表面密度，并將其與酶活性關(guān)聯(lián)起來(lái)（圖2）。 高達(dá)12.1 ng/cm2（對(duì)應(yīng)于18 mN/m的表面壓力）時(shí)，觀察到線性相關(guān)性，表明活性的增加直接反映了酶表面密度的增加。 然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表面密度高于12.1 ng/cm2時(shí)，酶活性會(huì)突然下降。

圖3顯示了表面壓力對(duì)表面壓縮模量Cs-1的影響（定義49為表面壓縮性的倒數(shù)：Cs-1）[-A(?π/?A） ]T），以及DMPA朗繆爾單層中DSAP的酶活性。表面壓縮模量在圖3中是首選的，因?yàn)樗S著表面堆積而增加，并且也可以與單層的狀態(tài)相關(guān)。液體冷凝膜的Cs-1值通常高于50 mN/m。事實(shí)上，曲線中的斷點(diǎn)（在圖1中19（1 mN/m）處觀察到）伴隨著壓縮模量的突然增加（對(duì)于可忽略的面積/表面壓力變化，從55 mN/m到62 mN/m）此外，隨著表面壓力的增加，單層膜上的酶活性增加至均勻介質(zhì)中酶活性的91%，直到18 mN/m。盡管酶活性始終低于溶液中測(cè)得的酶活性，但與表面壓力無(wú)關(guān)，最大值與先前的報(bào)告21-23,50形成對(duì)比固定在固體載體上的堿性磷酸酶的酶活性，其在均相介質(zhì)中的活性范圍為10%至45%。事實(shí)上，這些研究中從未使用過(guò)低于20 mN/m的表面壓力，因?yàn)閱螌拥母邏嚎s性阻礙了其向固體載體的轉(zhuǎn)移。

此外，一些研究51揭示了Na+/K+-ATP酶活性與周圍膜脂的堆積之間的強(qiáng)烈相關(guān)性，盡管膜組成也表現(xiàn)出顯著的影響。

在空氣/液體界面觀察到的DSAP的最大活性發(fā)生在18 mN/m的表面壓力下（圖3）。如表面壓縮模量Cs-1的增加所示，酶活性在該值以上突然下降，單層壓縮性也隨之下降。這一結(jié)果可以解釋圖2中觀察到的表面密度高于12.1 ng/cm2時(shí)酶活性急劇下降的原因。通過(guò)對(duì)比分析壓縮模量與表面密度相比，壓縮模量的顯著增加（與單層的表面堆積有關(guān)）成為影響酶活性的主要因素，超過(guò)18 mN/m。值得注意的是，與在35-165 mN/m范圍內(nèi)觀察到的Cs-1的顯著變化無(wú)關(guān)（π在19和30 mN/m之間），酶活性幾乎保持不變，在均勻培養(yǎng)基中約為活性的50%。這一結(jié)果與報(bào)道的在30 mN/m表面壓力下轉(zhuǎn)移的DMPA/DSAP混合單層23 LB膜的43%活性密切相關(guān)，盡管蛋白質(zhì)表面密度顯著較高（179 ng/cm2）。事實(shí)上，在相同表面壓力下，表面密度的增加導(dǎo)致酶活性顯著降低，這表明GPI錨定酶的活性不僅取決于蛋白質(zhì)表面密度，還取決于混合單層或分子表面堆積的可壓縮性。

圖2.估計(jì)酶表面密度的影響（Γ）關(guān)于PNPPA酶活性。酶活性表示為在均勻介質(zhì)中測(cè)得的酶活性的百分比。最大值對(duì)應(yīng)于12.1 ng/cm2的酶表面密度。0-12 ng/cm2的范圍對(duì)應(yīng)于0-18 mN/m的表面壓力；但是，觀察到，在圖中所示的最高表面密度中，曲線不是t線性。圖3更好地分析了對(duì)表面壓力的依賴性。

圖3.（9）在幾種表面壓力下，DSAP/DMPA（1:3500，mol:mol）混合單分子膜中DSAP的PNPPA酶活性。（b）DSAP/DMPA混合單分子膜的壓縮模量。酶活性表示為均相介質(zhì)中估計(jì)值的百分比。

綜上所述，酶活性降低超過(guò)18 mN/m（每平方厘米12納克DSAP）與混合單分子層的液體凝聚相的實(shí)現(xiàn)相一致。因此，酶通過(guò)其錨插入的基質(zhì)包裝條件的變化可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的柔韌性產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，這是其功能活性的必要條件，盡管多肽部分之間的距離tive站點(diǎn)位于，并且接口。

然而，表面壓力和催化活性數(shù)據(jù)不能提供表面堆積如何影響酶/脂質(zhì)混合單層形態(tài)的信息。

熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是一種通過(guò)熒光探針在薄膜中的分布來(lái)顯示氣液界面形貌的有趣方法。當(dāng)使用脂質(zhì)探針時(shí)，對(duì)比度取決于它們?cè)谘簩拥臐饪s和膨脹相中的相對(duì)溶解度，而使用熒光標(biāo)記的酶可以識(shí)別富含蛋白質(zhì)的區(qū)域。圖4顯示了使用約1 mol%用熒光素標(biāo)記的DSAP獲得的DMPA/DSAP混合單層的熒光顯微照片。在0 mN/m表面壓力下，在明亮的連續(xù)場(chǎng)上觀察到黑斑。在這種表面壓力下，純DMPA單分子膜中不存在這些結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域應(yīng)該對(duì)應(yīng)于在混合單分子膜上發(fā)生的某種分離，這種分離是由蛋白質(zhì)的存在引起的。隨著表面壓力的增加，可以觀察到一些這樣的區(qū)域聚集成分形圖案。從FM顯微照片中獲得的最重要的發(fā)現(xiàn)是DMPA/DSAP單分子膜中存在不均勻疇，隨著表面壓力的增加，這些疇變得更亮。在較高的表面壓力下，可能會(huì)看到具有三種不同光強(qiáng)度模式的區(qū)域。較亮的區(qū)域?qū)?yīng)于富含蛋白質(zhì)的區(qū)域，而較暗的區(qū)域應(yīng)對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)貧乏的區(qū)域，因?yàn)樵诳紤]標(biāo)記比率時(shí)，熒光素標(biāo)簽之間的熒光猝滅是極不可能的。在高于18 mN/m的表面壓力下觀察到的強(qiáng)亮度對(duì)應(yīng)于混合單層壓縮模量突然增加的范圍（見圖3）。

圖4.DSAP/DMPA單分子膜（1:3500，mol:mol）在幾種表面壓力下的熒光顯微照片。

高達(dá)18 mN/m時(shí)，分形圖案與單個(gè)暗疇共存。在20 mN/m時(shí)，暗域不再是離散的，但發(fā)生了滲流機(jī)制，導(dǎo)致明亮的富含蛋白質(zhì)的域最終分離。這幅圖可以歸因于富含蛋白質(zhì)的相被貧蛋白質(zhì)相包圍，呈分形滲流結(jié)構(gòu)分布。這與其他顯示GPI錨定蛋白在液相有序相中被劃分的報(bào)告一致。27

據(jù)報(bào)道，GPI錨定的蛋白質(zhì)在脂質(zhì)界面形成（或誘導(dǎo)形成）聚集體。6,8,27,30-34,52在生物膜模型如雙層膜、脂質(zhì)體、單層膜和Langmuir-Blodgett膜中也觀察到了這些簇。27,24,34，這些簇群是否是GPA介導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或脂質(zhì)組成的結(jié)果尚待闡明。17,32 FM研究的結(jié)果（圖4）表明DMPA/DSAP混合單分子膜中存在相分離以及脂質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體。

提出了將表面密度和表面堆積與催化活性關(guān)聯(lián)的模型。提出了一個(gè)通過(guò)脂質(zhì)表面堆積和氣液界面酶表面密度調(diào)節(jié)DSAP方向和催化活性的模型（圖5）。堿性磷酸酶的催化位點(diǎn)可能位于GPI錨的另一側(cè)。1,53在本研究所用的系統(tǒng)中，疏水錨應(yīng)位于與DMPA?；嗷プ饔玫目諝?水界面，而催化位點(diǎn)必須朝向亞相，其中基材PNPP溶解。在低表面壓力下（圖5A），催化活性主要取決于蛋白質(zhì)表面密度?？紤]到表面壓縮定義了平均酶表面密度（圖2），當(dāng)表面壓力上升到18 mN/m時(shí)，界面中的疏水錨定排列可能有利于多肽部分向亞相調(diào)整（圖5B）。這將允許PNPP在擴(kuò)散控制過(guò)程中進(jìn)入酶的催化部位，從而提高酶的活性，達(dá)到均相培養(yǎng)基中獲得的活性的91%（圖3）。盡管增加了酶的估計(jì)平均表面密度（圖2），但混合單層的進(jìn)一步壓縮會(huì)導(dǎo)致催化活性的突然降低，與單層壓縮性的顯著降低（圖3）和蛋白質(zhì)簇的形成（圖4）相關(guān)，這可能會(huì)影響底物對(duì)催化部位的可達(dá)性（圖5C）。該模型解釋了在30 mN/m條件下轉(zhuǎn)移的DSAP/DMPA混合LB膜23之前獲得的催化活性極限值約為43%。

圖5. 在（A）以下、（C）以上和（B）值的表面壓力下，酶/磷脂混合單層的DSAP取向示意圖模型，觀察到單層表面壓縮模量的突然增加。 橫向箭頭表示表面壓力（π）、估計(jì)的酶表面密度（Γ）和壓縮模量（Cs-1）的增加方向。

分子表面包裝對(duì)于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調(diào)制作用的影響——摘要、介紹

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